***液相色谱仪定性定量分析和提纯精制的通用规则
1、范围
本标准适用于使用***液相色谱仪对无机 、有机化合物的定性定量分析及提纯精制 ,以 及对高分子化合物的分子量的测定的一般要求 。
2、规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本准 的条款。凡是注日期的引用文件 、其随后所有的修*** (不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的***新版本。凡是不注日期的引用文件，其***新版本适用于本标准。
3、术语和定义
3.1、***液相色谱仪：进行***液相色谱分析的仪器 。
3.2、分析物：样品或样品溶液中存在的待分析的目标组分。
3.3、样品溶液：样品溶解在其中的溶液或提取用于分析的溶液。
3.4、试样溶液：用于测试的样品溶液本身或预处理过的样品溶液。
3.5、泵：驱动流动相 (洗脱剂)的设备 。
3.6、自动进样器：自动将试样溶液接连地***进到液相色谱仪的柱子中的设备。
3.7、柱温箱：色谱柱置于其中的容器 。
3.8、色谱柱管：柱填料被填充在其中的圆形柱管、其两端装配有过滤器等部件。
3.9、对称因子：表征色谱峰的对称程度的因子。
3.10、柱前衍生化：样品组分在进到色谱柱之前，与衍生***反应进行衍生化的过程。
3.11、柱后衍生化：样品组分在色谱柱分离之后，加衍生***到洗出液中进行衍生化的过程。
3.12、标准溶液：其特征值如浓度或分子量是已知的并确定足以用作液相色谱分析的标样的溶液。
3.13、分离模式：主要由液相色谱分离机理进行分类的操作模式。
3.14、稀释标准溶液：被稀释成一定浓度的标准溶液。
3.15、混合标准溶液：通过混合一种以上标准溶液或稀释标准溶液制备的含规定浓度样品组分的溶液 。
3.16、内标物：内标法中用作标样的物质。
3.17、分子量分布：与分子量有多分散性的化合物有关。表示了各种分子作为分子量函数的量 。
3.18、分级：通过色谱柱分离和洗脱取得分析物的操作。
3.19、流分：通过分级操作分离得到的溶液。
3.20、方法确认：证明使用***液相色谱仪的分析方法适合分析目的的各种测试。
4、***液相色谱仪概述
4.1、液相色谱法(LC)是一种具有下述特征的物理和化学分离分析方法。它使用液体作为流动相，每种分析物在色谱柱的固定相和流动相问的相互作用存在差别，这种差别被利用来分离混合物 。流动相被加压传送以取得短时问内的***分离的液相色谱分析方法被称为***液相色谱法(H PLC)。 用于***液相色谱法的设各被称为***液相色谱仪。
4.2、LC可应用于测定非挥发性或者热不稳定性化合物，这些化合物难于用气相色谱法测定。囚为LC的扩散速度比气相色谱法慢 ,所以其分离能力比气相色谱法差 。虽然 LC的分离能力没有气相色谱法高 ,但是它具有优良的定量能力和容易得到分离的化合物的流分的特点 。LC不仅可应用于一般有机化合物 ,而且也可应用于离子化合物、天然产物 、聚合物以及其他广泛领域 。
4.3、通过综合分析***液相色谱法所使用的固定相和流动相，可以认识其各种分离机理 。表1列 出了***液相色谱法的分类及其分离机理的特点 、典型柱填料及其用途。
4.4、***液相色谱仪的基本配置如图所示 。HPLC由下列部件组成：流动相提供单元(液体泵)、进样器 、色谱柱和柱箱 、检测器 、数据处理机和记录仪，流动相的流速由泵设定 , 一定体积的流动相被传送到进样器 ,再到色谱柱。泵输送流动相的流速范围通常在 0.01mL/min~10mL/min，常用往复式柱塞泵，当使用梯度洗脱法时 ,使用 1-4个单元泵或者一个梯度器。
4.5、通常用微量***器量取一定体积的样品溶液 ,注入进样阀,扳动阀钮将样品溶液注入色谱柱。有时使用自动进样器按序列自动进多个样品。
4.6、***液相色谱仪使用的柱填料其有相对均匀的颗粒尺寸，粒径一般在1um~20um之间,填料被装填在内径1mm~12mm的不锈钢或塑料的色谱柱管***,柱长一般几十厘米或者更短，填料的粒径和柱子的尺寸根据其用途而有所不同。
4.7、分析物被色谱柱分离，然后基于其物理 、光学 、电 、化学及其他特性被检测器检测 ,***液相色谱仪的典型检测器是紫外可见光检测器。通常这种检测器的流通池体积在4uL~20uL之间,它测量被分离后的分析物在一定波长下的吸光度(吸收强度 )。 其他检测器包括示差折光指数检测器 、荧光检测器 、电化学检测器 、电导检测器 、质谱仪等 。***液相色谱仪使用的典型检测器的特点列于表2。当需要选择性检测或 g/L量级以下的高灵敏度检测时,依赖于分析物特征使用不同的检测器。
4.8、如果分析物不能直接检测或者高灵敏检测不可能实现 ,则可使用柱前衍生化或柱后衍生化，前者是分析物在进到色谱柱之前进行的衍生化 ,而后者是分析物被色谱柱分离之后衍生***同洗脱液进行混合进行的衍生化。
4.9、检测器得到每个分折物的响应并转化成电信号 ,然后送到数据处理机，记录检测器得到的信号对时间作图得到如图3所示的色谱图，数据处理机基于得到的色谱图进行各种参数运算 ,对分析物进行定性定量分析。当使用保留值对分析物进行定性时 ,用其保留值 (保留时问等)同相同条件下的标准样品的保留值进行比较 ,当使用质谱或二极管阵列检测器对分析物进行定性时 ,用分析物的谱图同标样的谱图进行比较。当进行定量分析时 ,从色谱图得到峰面积值或峰高值 ,将其代入含分析物的标准溶液制得的标准曲线迸行定量测定 。
4.10、另一方面 ,也有可能通过收集与色谱图上色谱峰相对应的流出液对分离的分析物进行等分收集 ,进行提纯 ,即制备型液相色谱法。
5、水 、***和溶剂
5.1、水：本标准使用的水应是通过蒸馏或离了交换等方法精制的水 ,或者通过反渗透 、蒸馏 、离子交换等方法结合精制的水 ,水质不应干扰分析 。
5.2、***：***应是分析纯***或质量更好的***，***不应干扰分析。
5.3、溶剂：溶剂应足***液相色谱仪级的产品或质量相当或更好的产品。它们不应干扰所使用的检测器的性能。
6、取样及预处理的操作
***液相色谱仪分析要求按样品的分析目的选择合适的取样方法。根据样品形式和分析目的,样品可直接进***液相色谱仪 ,或者对分析物进行萃取 、衍生 、浓缩等预处理。
6.1、取样：取样应根据分析目的、样品性质及测试项目使用***佳方法进行 ,考虑具有样品代表性及能区分每个样品特征的差异。如果有专项标准 ,则按该标准迸行取样操作。为了防止由于老化之类的外部因素引起的变化 ,预处理和进样的过程应尽可能快地进行 。如果样品需要贮存 ,耍预先确认样品不会囚为贮存和转移运输发生变化 ,如果在初步试验和实际测定时样品量和分析物浓度存在较大差别 ,则设定的条件将无效 。如果怀疑样品发生了变化 ,则要采取相应对策。用于取样和样品贮存的容器和器具不应含有任何吸附样品或溶解于样品的物质 。贮存容器应贴上必要的警示标签。如果为了保证数据的可靠性需要迸行重复测定 ,则相同样品必须同时在两处或两处以上的 取样点抽取 。
6.2、预处理：
样品在进***液相色谱仪之前 ,应针对分析目的 、样品性质和测试项目使用***合适的方法进行预处理。预处理一般可改善特性 、精密度 、灵敏度等，消除测量的干扰物质 ,保护色谱柱和仪器免予损坏 ,简化测定操作过程 ,以及使分析物保持稳定 。
预处理包括下列过程 :称重 、蛋白质脱除、 萃取 (液液萃取 、固相萃取 、溶剂蒸馏 、超滤分离、超临界流体萃取等)、净化 (液液萃取 、固相萃取等 )、 脱水 、脱盐 、浓缩 、定容 、 衍生 、标准物加入 、溶剂调整(衍生化 、溶解在适于进样的溶剂中)等等。如果有专项标准,则按该标准进行预处理 ,如果加入内标物 ,在色谱图上内标物应与样品基质很好地分离。其保留时间应与目标组分的保留时间差别不大。如果使用质谱 ,与内标物的分离不一定是必需的。样品应溶解在少量其淋洗能力等于或小于流动相的溶剂中。溶剂可能影响稳定性和目标组分的分离 ,因此应谨慎选择 。必要时 ,使用0.2um~0.5um的过滤膜对样品进行过滤以除去不溶物 。预处理有可能引起来 自*** 、容器 、环境等的污染 ,引起杂质的混入以及分析物的损失 ,应引起注意。
7、仪器配置
7.1、流动相供应单元：输送流动相(洗脱剂)到色谱柱的供应单元 ,主要由下列部件组成 :
7.1.1、洗脱剂储液器：洗脱剂储液器应使用不影响流动相 (洗脱剂 )化学组成的材料制成 ,洗脱剂储液器应防止在使用过程中环境囚素对流动相的污染 ,如蒸发变质等。
7.1.2、脱气器：脱气器被用来连续脱除溶剂在流动相(洗脱剂）中的空气 ,以免由于仪器内温度压力变化引起的气泡问题 ,从而保证稳定的流速和信号背景。
7.1.3、供液泵：以***流速将流动相(洗脱剂)输送到色谱柱的泵必须满足下列要求 :
a) 流速范围宽 ;
b) 流速精度高;
c) 流量脉动低 ;
d) 在较宽的压力范围内具有稳定的输液能力;
c) 与液体接触的材料具有优异的化学隋性 ,
f) 易于更换流动相 。
7.1.4、梯度洗脱单元：梯度洗脱单元由控制器和混合器组成 ,控制器可以连续改变混合流动相(洗 脱剂 )的组成而混合器将获得均匀的混合溶液。混合比的设定范围要宽 ,浓度要***。
7.2、进样器：进样器的材料和构造应确保所进的样品没有吸附保留,进样重复性好。如果用自动进样器自动进行许多试样的进样 ,那么它应具有以下基本功能 :重复性、定量进样准确性、保留小 、***的样品量等等。如果有预期的用途需要 ,则应加上冷却功能 ,以便增加制备好的样品数量和 降低样品组分的分解和蒸发 。
具有样品预处理功能或柱前衍生化功能的自动进样器也可能用到。
7.3、分离单元
7.3.1、色谱柱：根据分折目的,使用本标准第9章叙述的色谱柱。从进样器到色谱柱入口的流路和从色谱柱出口到检测器的流路应使用死体积尽可能小的管路 ,以免样消除谱带扩散 。可使用保护柱来防止分析柱性能损坏 。
7.3.2、色谱柱箱：使用色谱柱箱可提高分离分析的稳定性从而确保分析精度。色谱柱箱应具有温度控制功能 。控制温度可优化色谱柱性能 、增强分离选择性以及防止柱温受环境温度变化的影响。
7.4、检测器：洗脱剂从色谱柱进入检测器的微流池 ,检测器按照不同原理以流动相作为背景检测分析物的浓度或体积。
7.4.1、吸光度检测器：吸光度检测器检测样品组分在紫外可见光区的吸光度 。按分析物的吸收特性确定吸收波长。常用的吸光度检测器类型是分光光束通过流动池中的样品组分 ,到二极管阵列检测器 ,产生光谱 ,测量各波长下的吸光度变化。通过使用各波长下的色谱图和每个组分的保留时间可以获得定性分析结果和峰组分纯度的确认 。
7.4.2、示差折光指数检测器：样品组分的流出引起流动相折光指数改变，这种改变被检测器以折光指数之差进行检测。
7.4.3、荧光检测器：荧光检测器检测样品中某个组分受到激发光激发在特定波长下的荧光强度。为了设定***佳波长和定性确认峰组分，有些荧光检测器具有进行激发 、激发产生的荧光波长扫描以及荧光光谱采集等功能。
7.4.4、电化学检测器：电化学检测器检测样品组分在加有特定电压的工作电极下迸行氧化还原反应产生的电流。
7.4.5、电导检测器：电导检测器检测流动相溶液和样品组分之间电导的差别。
7.4.6、质谱检测器：质谱检测器将从色谱柱流出的样品组分进行离子化 ,然后按照质荷比检测这些离子 。
7.4.7、其他类型检测器
其他类型检测器包括下列检测器 :
a) 红外光谱检测器(IR);
b) 旋光度检测器(OR)，圆二色检测器(CD)；
c) 火焰离子化检测器(FID):
d) *** 检 测 器 (RI);
c) 介电检测器 ;
f) 化学发光检测器(包括生物发光）（CLD);
g) 原子吸收分光光度检测器(AA);
h) 电感耦合等离子体发射光谱检测器(ICP- AEs);
i) 高频等离子体质谱检测器;
j) 热检测器 ;
k) 光散射检测器 ;
l) 黏度检测器 |
m) 离子电极检测器 ;
n) 超声波检测器;
o) ***仪检测器 。
7.5、数据处理机：数据处理机显示色谱图和计算得到的定量结果。计算可通过制备校准曲线 ,用 浓度对保留时间 、峰高、峰面积等作图。有些数据处理机具有光谱分析功能。
7.6、附件：根据分析目的 ,如果必要 ,应提供下列附件 ;
a) 计算机(用于工作站 ,用于数据处理和仪器控制 );
b) 路径切换阀(柱切换 、循环 、反冲等);
c) 流分收集器 ;
d) 柱后反应器 .
8、洗脱剂
8.1、洗脱剂的选择：应按分离模式或检测模式选择洗脱剂 ,以满足要求。
8.1.1、要求洗脱剂应满足下列要求 :
a) 能合适地分离分析物 ;
b) 不会化学的或物理的***柱填料 ;
c) 能溶解样品而没有*** ;
d） 适合检测器 ;
e) 脱除固体物质;
f) 脱气。
8.1.2、按分离模式选择(见表3)
2) 为了脱除固体物质 ,洗脱剂通常应通过孔径0.5um或更小的膜进行过滤 。如果使用粒径为3um或更小的柱填料 ,使用的过滤膜的孔径应是粒径的 1/I0。
3) 如果***液相色谱仪具有脱气装置 ,则不必预先脱气。
8.1.3、按检测器选择(见表4)
8.2、洗脱剂的制备
8.2.1、混合洗脱剂的制备：***适合分离的洗脱剂通常用两种或更多种溶剂充分混合制备 。除了尺寸排阻色谱 ,很少使用单一溶剂 。关于混合洗脱剂的制备 ,应注意以下几点 :
a) 使用能够完全混合的溶剂 ;
b) 充分搅拌以获得均匀组成 ,
c) 混合洗脱剂的组成可用室温下混合前的体积比表示 。混合洗脱剂的体积不一定等于各溶剂体积的总和。因此 ,各溶剂的体积应分别测量;
d) 如果混合时溶液温度改变,应冷却至室温 ;
c) 当***和缓冲溶液或离子对***混合时如果产生沉淀的可能性很高 ,应使用孔径0.5um或更小的过滤膜进行过滤除去沉淀 ;
f）依赖于贮存条件 ,有些洗脱剂可能容易发生组成变化 、化学变化 、吸水等。
8.2.2、洗脱剂脱水和溶剂的水饱和：如果样品组分遇水不稳定 ,或者像硅胶或其他一些对水很亲和的物质被用作固定相 ,应注意洗脱剂中的水分 ,并且用前应迸行脱水。在吸附色谱法中,水分严重影响分离选择性 ,可使用特定的水分饱和的溶剂制备洗脱剂 。
8.2.2.1、洗脱剂的脱水：脱水应使用合适的干燥剂 。醇类和***可以用3A和4A分子筛脱水 。
8.2.2.2、溶剂的水饱和：将***同稍稍多于饱和水量的水混合 ,在高于使用温度5℃~10℃的温度下充分搅拌 ,然后在使用温度下搅拌。静置分层后,取有机相层即制得100%水饱和的溶剂。将其按一定比例同完全脱水的溶剂混合 ,即可制得一定饱和度的水饱和溶剂。
8.2.3、洗脱剂的pH值调节方法：
在反相分配色谱中,可加入少量的酸或碱来调节洗脱剂的pH值,洗脱剂的pH值也可能由于空气中的二氧化碳的溶解作用受影响。如果 pH值 严重影响分离,必须使用缓冲溶液,缓冲溶液在所用的pH值范围内其有足够的缓冲能力.如果用***同缓冲溶液混合制备洗脱剂 ,混合比将影响氢离子浓度，但是混合前缓冲溶液的pH值通常应就是洗脱剂的 pH值。
9、色谱柱和柱填料
9.1、色谱柱
9.1.1、色谱柱的标记：色谱柱多种多样，色谱柱的标记除了柱填料的名称外,还要指明色谱柱管的材料 、长度和内径。
9.1.2、色谱柱管的材料：用作色谱柱管的材料应布足够的强度 、有光滑的内表面、对洗脱剂和分析物惰性。例如有不锈钢 、聚醚醚酮(PEEK)、 玻璃 、衬玻璃不锈钢 、石英管等 。
9.1.3、色谱柱的分类：依赖于分析样品的类型 、进样量和特点以及分析条件 ,色谱柱有不同的尺 寸。按内径可以将色谱柱分类如下 :
a) 半制备柱:内径12mm~50mm(不含50mm);
b) 通用柱:内径3mm~12mm(不含12mm);
c) 半微 柱 :内 径1mm~3mm(不含3mm):
d) 微柱 :内径1mm以下。
9.2、柱填料：柱填料通常是相对均匀的颗粒 ,粒径范围 1um~20um,或者是具有问等效果的棒状连续体 。填料在工作条件下具有物理化学稳定性。
柱填料材料有硅胶类的无机物 、聚***凝胶类的聚合物,以及用上述材料作母体在其表面上化学键合有机分子的物质。
9.3、分离方式和色谱柱填料：按照色谱柱填料和洗脱剂的组合 ,***液相色谱仪有多种分离方式 。按分析物的化学 、物理特忤 ,合理地选择分离方式。
9.4、柱性能评价：色谱柱条件可用峰型、理论板数 、对称因子等参数评价 。色谱柱能以寿命 、分离能力 、选择性 、***大样品负荷等参数评价。
当评价色谱柱性能时 ,应在一定条件下进行 ,这些条件不受环境和仪器形响 ,保证获得重复性。
10、仪器安装的环境要求和安全
10.1、环境要求：安装***液相色谱仪的房房间一般应满足下列条件：
a) 温湿度应在仪器规定的范围内且不会突然改变 ;
b) 没有震动和阳光直射 ;
c) 洁净无尘 、无腐蚀性气体 ,有良好的通风 ;
d) 没有强磁场和电场 ;
e) 电源电压 、 容量和频率符合仪器规定 ,电压波动在&plu***n;10%以内,没有频率波动 ;
f) 提供接地屯阻小于100Ω 的接地点。
10.2、安全：为安全目的 ,应注意下列事项 :
a) 分析使用的样品和化学***在处理时应注意其***性 、***性 、毒性或危害性，废液应该按照环保规定 ,在进行安全和无害化处理后弃置。***物质和***和***物质应该按照相关***进行处理 ;
b) 将仪器接地 ;
c) 当使用压力容器内气体时 ,要遵从相关规定 。如果其容器置于仪器附近 ,则容器应该固定到基座 、墙璧 、实验台上等等 ,以免翻倒 ;
d) 在操作仪器前 ,耍彻底检查管路 、按头等处足否漏液和漏气 ;
e) 直接接触仪器内部有可能引起*** 。在检查和维修时 ,应先切断电源 ;
f) 有些检测器使用光源灯 ,工作时会发射紫外线 ,因此在维护和更换灯时应戴护目镜。光源灯工作时发热 ,不得触摸 ;
g) 仪器有可能产生电磁干扰 ,或者受其他仪器的电磁干扰 ,应给予注意 ;
h) 如果直接用于接触生物样品(*** 、血浆 、*** 、尿样等 ),有可能引起***，须小心处理这些样品。 要注意防止样品直接接触
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